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膽固醇轉運蛋白GramD1C調控自噬啟動和線粒體生物能量學

更新時間:2022-12-09      點擊次數:1160
圖片

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文獻內容講解

巨自噬(shi)(以下(xia)簡(jian)稱自噬(shi))涉及膜(mo)的初始形(xing)成,將細(xi)胞質中需(xu)要分解(jie)的物(wu)質隔離形(xing)成雙膜(mo)自噬(shi)體,自噬(shi)體隨后與溶(rong)酶體接(jie)觸,進(jin)而(er)融合,從而(er)使物(wu)質分解(jie)和由此產(chan)生的大分子循環,以在饑(ji)餓和細(xi)胞應激期(qi)間獲得(de)穩態。

自(zi)噬體的生物(wu)發(fa)(fa)生通(tong)過ULK1激(ji)酶復合物(wu)和(he)III類磷脂酰肌醇(chun)3激(ji)酶復合物(wu)1(PIK3C3-C1)聚(ju)集(ji)到內(nei)質(zhi)網(wang)(ER)相關位點(dian)啟(qi)動,新形成的自(zi)噬體即(ji)從這些(xie)位點(dian)發(fa)(fa)出。自(zi)噬體膜(mo)很大程度上(shang)缺乏跨膜(mo)蛋白,因此認為其形成受膜(mo)相關蛋白及其脂質(zhi)組成和(he)分布(bu)的調節。

前人研究表明(ming),自噬(shi)體(ti)富含不飽和脂肪酸(suan),而這(zhe)些脂肪酸(suan)是(shi)自噬(shi)體(ti)形成(cheng)所(suo)必需(xu)的(de)(de)(de)。這(zhe)些研究表明(ming),降低(di)膜序(xu)有利(li)于自噬(shi)的(de)(de)(de)啟動(dong),可能(neng)是(shi)通過產(chan)生已(yi)知的(de)(de)(de)自噬(shi)體(ti)形成(cheng)所(suo)需(xu)的(de)(de)(de)柔性高(gao)度彎(wan)曲的(de)(de)(de)膜。除(chu)了磷脂、膽固醇是(shi)哺乳(ru)動(dong)物膜的(de)(de)(de)一(yi)個(ge)重要組成(cheng)部(bu)分(fen),它的(de)(de)(de)豐(feng)度也是(shi)膜秩序(xu)和流動(dong)性的(de)(de)(de)決定因素。

細(xi)(xi)胞(bao)內膽(dan)(dan)固醇(chun)(chun)(chun)水(shui)平通過生(sheng)物發(fa)生(sheng)和(he)細(xi)(xi)胞(bao)外(wai)膽(dan)(dan)固醇(chun)(chun)(chun)攝取進行雙重調節。除了低密度脂(zhi)蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)受體(LDLR)途徑外(wai),一些膽(dan)(dan)固醇(chun)(chun)(chun)轉運(yun)蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)也被(bei)證明直接從質膜(PM)介導膽(dan)(dan)固醇(chun)(chun)(chun)的輸入(ru)和(he)胞(bao)內轉運(yun)。這種膽(dan)(dan)固醇(chun)(chun)(chun)轉運(yun)蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)例如 GramD 家族蛋白(bai)(bai)(bai)(bai)(由GramD1A、GramD1B、GramD1C(也稱為ASTER蛋白(bai)(bai)(bai)(bai))、GramD2和(he)GramD3),以其(qi)N-末端區域的脂(zhi)質結(jie)合(he)PH相似(si)結(jie)構域命名。在這5個(ge)(ge)成員中,只(zhi)有GramD1A、GramD1B和(he)GramD1C(這里統(tong)稱為GramD1S)含有一個(ge)(ge)與甾醇(chun)(chun)(chun)結(jie)合(he)的巨大結(jie)構域,允許它們促進PM到ER膽(dan)(dan)固醇(chun)(chun)(chun)的輸入(ru)。


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     ;                                   S7 c GRAMD1C在自噬中的調控(kong)示意圖(tu)

GramD1S的缺失導(dao)致細(xi)(xi)胞膜中(zhong)可(ke)及膽固醇(chun)的積(ji)累,而GramD1A和GramD1B缺失的小(xiao)鼠巨噬細(xi)(xi)胞也表現出甾醇(chun)調(diao)節元件結合蛋白2(SREBP2)靶基因的上調(diao)表達(da),表明ER膽固醇(chun)降低。由于對GramD家(jia)族(zu)蛋白質的研(yan)究數量(liang)有限(xian),它們的生物(wu)學重要(yao)性仍未深(shen)入了解。


膽固醇(chun)耗(hao)竭促進自噬(shi)啟動

此項研究用快速清除細(xi)胞膜(mo)中(zhong)膽(dan)(dan)固(gu)(gu)醇的(de)(de)(de)MBCD分析(xi)了膽(dan)(dan)固(gu)(gu)醇耗(hao)盡后饑餓(e)誘(you)導的(de)(de)(de)自(zi)噬(shi)的(de)(de)(de)短期影(ying)響。對照細(xi)胞相比,在基(ji)礎條件下(xia),膽(dan)(dan)固(gu)(gu)醇耗(hao)竭(jie)導致(zhi)LC3B(LC3B-II)的(de)(de)(de)膜(mo)結合形式增(zeng)加了三倍,這在缺乏膽(dan)(dan)固(gu)(gu)醇的(de)(de)(de)饑餓(e)細(xi)胞中(zhong)進一步增(zeng)強(qiang);據內源性LC3B點狀體(ti)的(de)(de)(de)免疫熒光顯微鏡(jing)觀察,膽(dan)(dan)固(gu)(gu)醇耗(hao)竭(jie)增(zeng)加了Fed和(he)Starved細(xi)胞中(zhong)自(zi)噬(shi)體(ti)的(de)(de)(de)形成。這些結果表明,膽(dan)(dan)固(gu)(gu)醇耗(hao)竭(jie)促進自(zi)噬(shi)誘(you)導,并(bing)增(zeng)強(qiang)饑餓(e)誘(you)導的(de)(de)(de)自(zi)噬(shi)。


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GrAMD1C是饑餓誘(you)導自噬的負(fu)調節因(yin)子(zi)

為(wei)了闡明細(xi)胞(bao)膽固(gu)(gu)醇調節(jie)劑是(shi)否也影響自(zi)(zi)噬(shi)(shi),設計實驗耗竭在(zai)膜接(jie)觸點作為(wei)非泡(pao)狀細(xi)胞(bao)器間膽固(gu)(gu)醇運(yun)動(dong)中介的(de)膽固(gu)(gu)醇轉運(yun)蛋(dan)白。鑒于復(fu)合物通過其C端(duan)區域22和GramD1A參(can)(can)與(yu)自(zi)(zi)噬(shi)(shi),為(wei)明確GramD1A家族的(de)其他成(cheng)員(yuan)是(shi)否也參(can)(can)與(yu)自(zi)(zi)噬(shi)(shi),用siRNA轉染穩定誘導表(biao)達自(zi)(zi)噬(shi)(shi)報告基因Mcherry-EGFP-LC3B(黃色自(zi)(zi)噬(shi)(shi)體,由于酸性溶酶(mei)體中EGFP猝滅而產生的(de)紅自(zi)(zi)溶酶(mei)體)的(de)U2OS細(xi)胞(bao),分別耗盡每(mei)個Gram家族成(cheng)員(yuan)。這些實驗數(shu)據表(biao)明,GramD1C介導的(de)膽固(gu)(gu)醇轉運(yun)調節(jie)饑(ji)餓誘導的(de)自(zi)(zi)噬(shi)(shi)。


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GrAMD1C調控(kong)自噬起始

U2OS細(xi)胞(bao)中(zhong)GramD1C耗竭(jie)導致了幾種早期自(zi)噬機制成分的增加,如ATG13、ATG16L1和PTDINs(3)P效應(ying)蛋白WIPI2B40;而且與膽(dan)固醇耗竭(jie)細(xi)胞(bao)中(zhong)的結果一致,研究發現(xian)GramD1C耗竭(jie)促(cu)進饑餓細(xi)胞(bao)中(zhong)EGFP-BAT的募集,這些結果提示GramD1C通過降低膜曲率抑制自(zi)噬體的啟動(dong)。


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GrAMD1C調控線粒體生物能量(liang)學

為了研究GramD1C是否可能(neng)調節內質網(wang)和(he)線粒體之間的(de)(de)膽(dan)固醇(chun)(chun)運動(dong),我們(men)在(zai)分離(li)的(de)(de)線粒體中(zhong)加入重組Mcherry標記的(de)(de)perfringolysin O(Mcherry-D4)膽(dan)固醇(chun)(chun)結合域,建立了一(yi)種線粒體膽(dan)固醇(chun)(chun)定量方法。后續通過一(yi)系列實(shi)驗證明GramD1C是線粒體膽(dan)固醇(chun)(chun)豐度和(he)線粒體生物能(neng)量學的(de)(de)負(fu)調節因(yin)子。



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Gram家族表達對CCRCC預后的(de)影響


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通(tong)過TCGA數(shu)(shu)據庫分(fen)析腎透明細胞癌(KIRC)腫瘤基因表達數(shu)(shu)據中(zhong)完整的(de)(de)Gram1C家(jia)族在CCRCC中(zhong)的(de)(de)參與情況,及患者(zhe)生存(cun)的(de)(de)相關性,發現(xian)GRAMD1C、GRAMD2B是腎透明細胞癌(CCRCC)患者(zhe)預(yu)后(hou)的(de)(de)不利因素;Gram家(jia)族成員可能(neng)是通(tong)過調節新陳代謝和癌細胞存(cun)活率(lv)來調節CCRCC患者(zhe)的(de)(de)總存(cun)活率(lv)。




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